PNGase F-Fast (sans glycérol)-HYI153
La PNGase F est la méthode enzymatique la plus efficace pour éliminer la quasi-totalité des oligosaccharides N-liés des glycoprotéines. Cette amidase clive la liaison entre les résidus GlcNAc et asparagine les plus internes des oligosaccharides à haut mannose, hybrides et complexes des glycoprotéines N-liées. Il est crucial, pour un contrôle efficace du procédé, d'obtenir rapidement une distribution précise des N-glycanes. L'hydrolyse et la libération des N-glycanes de l'anticorps par la PNGase F prennent généralement plusieurs heures, suivies de la dérivatisation des glycanes et de l'analyse par HPLC ou spectrométrie de masse. Une déglycosylation incomplète peut notamment fausser les résultats et ne pas refléter la composition réelle de l'anticorps thérapeutique. La PNGase F-Fast est un réactif amélioré qui libère les N-glycanes de l'anticorps thérapeutique en quelques minutes. Tous les N-glycanes sont libérés rapidement et sans biais, prêts pour l'analyse par chromatographie ou spectrométrie de masse, permettant ainsi une détermination rapide du glycoprofil des anticorps.
Composants
| Composants | Taille |
| PNGase F-Fast (sans glycérol) | 50 µl |
| Tampon PNGase F-Fast 5 × | 1000 µl |
Spécification
| Apparence | liquide clair incolore |
| Exoglycosidase | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F1 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F2 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F3 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase H | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Protéase | Aucune activité n'a pu être détectée. |
Propriétés
| Numéro CE | 3.5.1.52 (Recombinant issu de micro-organismes) |
| Poids moléculaire | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| point isoélectrique | 8.14 |
| pH optimal | 7.0-8.0 |
| Température optimale | 65 °C |
| Spécificité du substrat | Clivage des liaisons glycosidiques entre les résidus de GlcNAc et d'asparagine |
| Le clivage se situe dans les IgG | Déglycosylation et maintien de l'oligosaccharide intact |
| Activateurs | DTT |
| Inhibiteur | Fiche de données de sécurité |
| température de stockage | -25～-15 ℃ |
| Inactivation par la chaleur | Un mélange réactionnel de 20 µL contenant 1 µL de PNGase F est inactivé par incubation à 75 °C pendant 10 minutes. |
Applications
L'enzyme est utilisée pour la déglycosylation rapide des anticorps glycosylés, et la chaîne de sucre purifiée peut être utilisée ultérieurement par spectrométrie de masse pour identifier le glycotype de l'anticorps.
Figure 1 Spécificité de substrat de la PNGase F-Fast
Figure 2. Sites de clivage des IgG. La flèche rouge indique les sites de clivage des IgG.
Stockage
Conditions de transport : -25 à -15 °C
Conditions de conservation : -25 °C à -15 °C ; le produit ne doit pas subir plus de 5 cycles de congélation-décongélation. Il est recommandé de le conserver en petites quantités après la première décongélation. Pour une utilisation de courte durée, il peut être conservé entre 2 °C et 8 °C, pendant 30 jours maximum.
Conditions de réaction
Protocole en une étape
- Dissoudre 100 µg d'anticorps avec de l'eau déminéralisée pour obtenir un volume de 16 µl.
- Ajouter 4 µl de tampon 5×PNGase F-Fast et mélanger.
- Ajouter 1 µl de PNGase F-Fast et mélanger.
- Incuber la réaction à 50 °C pendant 10 min.
- Préparer les N-glycanes pour la dérivatisation en vue d'analyses ultérieures.
Protocole en deux étapes
Certains anticorps nécessitent une étape de préchauffage pour une déglycosylation efficace.
- Dissoudre 100 µg d'anticorps avec de l'eau déminéralisée pour obtenir un volume de 16 µl.
- Ajouter 4 µl de tampon 5×PNGase F-Fast et mélanger.
- Incuber à 80 °C pendant 2 min et refroidir sur glace.
- Ajouter 1 µl de PNGase F-Fast et mélanger.
- Incuber la réaction à 50 °C pendant 10 min.
- Préparer les N-glycanes pour la dérivatisation en vue d'analyses ultérieures.