PNGase F-HYI151
La PNGase F est la méthode enzymatique la plus efficace pour éliminer la quasi-totalité des oligosaccharides N-liés des glycoprotéines. La PNGase F est une amidase qui clive la liaison entre les résidus GlcNAc et asparagine les plus internes des oligosaccharides à forte teneur en mannose, hybrides et complexes présents dans les glycoprotéines N-liées.
Composants
| Composants | Taille |
| PNGase F | 50 µl |
| Tampon dénaturant pour glycoprotéines 10× | 1000 µl |
| 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 10 % NP-40 | 1000 µl |
Spécification
| Apparence | Liquide incolore |
| Pureté des protéines | ≥95 % (à partir de l'électrophorèse SDS-PAGE) |
| Activité | ≥500 000 U/mL |
| Exoglycosidase | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F1 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F2 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase F3 | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Endoglycosidase H | Aucune activité n'a pu être détectée. |
| Protéase | Aucune activité n'a pu être détectée. |
Propriétés
| Numéro CE | 3.5.1.52 (Recombinant issu de micro-organismes) |
| Poids moléculaire | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| point isoélectrique | 8.14 |
| pH optimal | 7.0-8.0 |
| Température optimale | 65 °C |
| Spécificité du substrat | Clivage des liaisons glycosidiques entre les résidus de GlcNAc et d'asparagine |
| Sites de reconnaissance | Glycanes N-liés, sauf s'ils contiennent du fucose α1-3 |
| Activateurs | DTT |
| Inhibiteur | Fiche de données de sécurité |
| température de stockage | -25～-15 ℃ |
| Inactivation par la chaleur | Un mélange réactionnel de 20 µL contenant 1 µL de PNGase F est inactivé par incubation à 75 °C pendant 10 minutes. |
Applications
Cette enzyme est utile pour éliminer les résidus de glucides des protéines.
Fig. 1 Spécificité de substrat de la PNGase F
Figure 2. Sites de reconnaissance de la PNGase F. Lorsque les résidus GlcNAc internes sont liés à l'α1-3 fucose, la PNGase F ne peut pas cliver les oligosaccharides N-liés des glycoprotéines. Cette modification est fréquente chez les plantes et certaines glycoprotéines d'insectes.
Définition de l'unité
Une unité (U) est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour éliminer plus de 95 % des glucides
à partir de 10 µg de RNase B dénaturée en 1 heure à 37 °C dans un volume réactionnel total de 10 µL.
Conditions de réaction
- Dissoudre 1 à 20 µg de glycoprotéine dans de l'eau déminéralisée, ajouter 1 µl de tampon dénaturant pour glycoprotéine 10× et H2O (si nécessaire) pour obtenir un volume réactionnel total de 10 µl.
- Incuber à 100 °C pendant 10 min, puis refroidir sur glace.
- Ajouter 2 µl de GlycoBuffer 2 10×, 2 µl de NP-40 à 10 % et mélanger.
- Ajouter 1 à 2 µl de PNGase F et de H2O (si nécessaire) pour obtenir un volume réactionnel total de 20 µl et mélanger.
- Incuber la réaction à 37 °C pendant 60 min.
- Pour l'analyse SDS-PAGE ou l'analyse HPLC.