Ribonucléase A (RNase A), issue du pancréas bovin HYC115
La ribonucléase A (RNase A) est un polypeptide monocaténaire comportant quatre ponts disulfure et d'une masse moléculaire d'environ 13,7 kDa. En tant qu'endoribonucléase, elle dégrade spécifiquement les résidus de cytosine (C) ou d'uracile (U) sur l'ARN simple brin. Plus précisément, le clivage reconnaît la liaison phosphodiester formée par le ribose en 5' d'un nucléotide donné et le groupe phosphate du ribose en 3' du nucléotide pyrimidique adjacent, hydrolysant ainsi le phosphate cyclique 2',3' en nucléoside phosphate 3' correspondant (par exemple, le pG-pG-pC-pA-pG est clivé par la RNase A pour produire le pG-pG-pCp et l'A-PG). La RNase A présente une activité maximale pour le clivage de l'ARN simple brin. La concentration de travail recommandée est de 1 à 100 µg/mL et elle est compatible avec divers systèmes réactionnels. De faibles concentrations de sel (0-100 mM NaCl) permettent de cliver l'ARN simple brin, l'ARN double brin et les chaînes d'ARN formées par hybridation ARN-ADN. Cependant, à des concentrations élevées (≥ 0,3 M), la RNase A ne clive spécifiquement que l'ARN simple brin. Son application la plus courante est l'élimination de l'ARN lors de la préparation d'ADN plasmidique ou d'ADN génomique. La présence ou l'absence d'activité enzymatique DNase lors de cette préparation constitue une contamination potentielle à surveiller. L'ébullition au bain-marie permet d'inactiver l'activité DNase. Ce produit peut également être utilisé pour des expériences de biologie moléculaire telles que l'analyse de la protection enzymatique de l'ARN et le séquençage de l'ARN.
Composants
| Composants | Taille-1 | Taille 2 | Taille 3 |
| Ribonucléase A (RNase A), provenant du pancréas bovin | 0,1 g | 1 g | 10 g |
Stockage
À conserver dans un endroit sec à une température de -25 à -15 °C. Durée de conservation : 2 ans.
Propriétés
| Source | pancréas bovin |
| Synonymes | Ribonucléase I ; RNase A ; Endoribonucléase I ; Ribonucléase pancréatique ; Ribonucléase 3'-pyrimidnooligonucléotidohydrolase ; |
| N° CAS | 9001-99-4 |
| Apparence | Poudre lyophilisée blanche |
| Poids moléculaire | ~13,7 kDa |
| Valeur de pH appropriée | 7.6 (Tranche d'activité 6-10) |
| Température appropriée | 60℃ (Plage d'activité 15-70℃) |
| Activateur | sel de sodium, sylvine |
| Inhibiteur | Inhibiteur de la RNase |
| méthode d'inactivation | Le chauffage ne permet pas l'inactivation ; il est recommandé d'utiliser des colonnes de centrifugation ou une extraction au phénol-chloroforme pour l'éliminer complètement. |
| Solubilité | Soluble dans l'eau (10 mg/ml) |
| Perte au séchage | ≤5,0% |
| Activité enzymatique | ≥60 KU/mg |
| point isoélectrique | 9.6 |
Préparation de la solution mère
Il s'agit là d'une des méthodes courantes de préparation d'une solution mère de RNase A. Elle peut également être préparée par d'autres méthodes, selon les méthodes traditionnelles utilisées en laboratoire ou décrites dans la littérature.
1. Solution mère (par exemple, directement dissoute dans du Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 ; ou dans une solution de Tris-NaCl)
1) Préparer une solution mère de RNase A à 10 mg/mL avec 10 mM d'acétate de sodium (pH 5,2) ;
2) Chauffer à 100℃ pendant 15 min ;
3) Laisser refroidir à température ambiante, ajouter 1/10 de volume de Tris-HCl 1 M (pH 7,4) et ajuster le pH à 7,4 (par exemple, ajouter 500 μL de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 à 5 mL de solution mère de RNase à 10 mg/mL) ;
4) Aliquoter et congeler à -25~-15℃, qui peut être stocké de manière stable jusqu'à 2 ans.
Remarque : L’ébullition d’une solution de RNase A en milieu neutre entraîne la formation d’un précipité. Si l’ébullition a lieu à un pH plus bas, la présence d’un précipité peut être due à des impuretés protéiques. Dans ce cas, les impuretés peuvent être éliminées par centrifugation à grande vitesse (13 000 tr/min), puis le précipité peut être aliquoté et congelé.
Notes
1. Ce produit a été soumis à la méthode appropriée pour éliminer toute contamination par la DNase lors du processus de production. Pour l'extraction classique d'ADN plasmidique ou d'ADN génomique (sans contrôle strict de la quantité d'ADN), l'ébullition à haute température n'est pas nécessaire et la solution mère peut être préparée directement. Pour les expériences exigeant un contrôle rigoureux des résidus d'enzyme DNase, il est recommandé d'ébullition à haute température ou d'utiliser une solution de RNase A exempte de DNase et de protéase.
2. La RNase A s'adsorbe fortement sur la verrerie, il est donc recommandé de mettre la solution dans un tube à centrifuger en plastique.
3. Pour les chercheurs qui effectuent simultanément des expériences complètes sur l'ARN, veillez à empêcher la RNase A d'interférer avec la précision des résultats des tests.
4. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de l'utilisation.
5. Ce produit est destiné uniquement à la recherche scientifique !