Kit de détection d'ARNdb RIG-1 HYJ522
Le gène I inductible par l'acide rétinoïque (RIG-I) fonctionne comme un récepteur de reconnaissance de motifs cytosolique qui initie l'immunité antivirale innée en détectant les ARN viraux exogènes. Sur le plan structural, RIG-I est composé de trois domaines fonctionnels principaux : le domaine d'activation et de recrutement de la caspase (CARD) pour la transduction du signal, le domaine hélicase à ARN DExD/H-box et le domaine C-terminal pour la liaison à l'ARN. Le domaine hélicase à ARN est associé à des activités d'hydrolyse de l'ATP dépendantes de l'ARN, qui sont activées lors de la liaison à l'ARN double brin (ARNdb), entraînant l'hydrolyse de l'ATP en ADP et en phosphate inorganique (Pi). Ce kit quantifie la teneur en ARNdb dans les échantillons en mesurant la production d'ADP lors de la réaction entre RIG-I et l'échantillon. Le dosage est réalisé sur une plaque multipuits et peut détecter des réactions dans des volumes aussi faibles que 5 µL. La détection comprend trois étapes :
1. Réaction RIG-I : Mélanger l'enzyme RIG-I, l'ATP et l'échantillon, puis incuber.
2. Épuisement de l'ATP : Ajouter un volume égal de réactif 1 pour épuiser l'ATP résiduel.
3. Détection de l'ADP : Ajouter le réactif 2 pour reconvertir l'ADP en ATP, qui est ensuite quantifié par une réaction luciférase/luciférine. Le signal luminescent est mesuré à l'aide d'un lecteur de plaques. La concentration d'ARNdb est calculée à partir d'une courbe standard.
Composants
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| Composants | 96 T | 384 T |
| Réaction de l'ATPase RIG-I | Enzyme RIG-I (1 µM) | 100 µL | 400 µL |
| Tampon de réaction RIG-I 10× | 0,25 mL | 1 mL | |
| 1M TNT | 20 μL | 50 μL | |
| ATP 10 mM | 25 μL | 100 μL | |
| Standard (UTP, 25 ng/μL) | 40 μL | 150 μL | |
| Standard (N1-Me-pUTP, 25 ng/μL) | 40 μL | 150 μL | |
| Mesure de l'ADP | Réactif 1 - Tampon d'essai | 0,5 mL | 2 mL |
| Réactif 1-Enzyme (5×) | 0,125 mL | 0,5 mL | |
| Réactif 1-0,5M MnCl2 | 25 μL | 100 μL | |
| Réactif 2 | 1,25 mL | 5 mL | |
| Plaque à 384 puits | 1 assiette | 1 assiette |
Stockage
1. Expédition sur glace sèche. Stocker le système à -25~-15℃.
2. Avant utilisation, tous les composants doivent être décongelés et soigneusement mélangés à température ambiante. Une fois préparés, répartir tous les réactifs en aliquotes et les conserver entre -25 et -15 °C. Préparer le système RIG-I et le réactif 1 juste avant chaque utilisation. Le réactif 2 peut être conservé à température ambiante (18–25 °C) pendant 24 heures sans perte de signal significative.
Matériel supplémentaire requis
1. Lecteur de microplaques à chimiluminescence.
2. Agitateur de microplaques.
3. Centrifugeuse portable.
4. Embouts et tubes à centrifuger sans RNase.