Kit ELISA d'inhibiteur de RNase - HYJ529
Ce kit utilise un test immuno-enzymatique (ELISA) couplé à un système biotine-streptavidine pour la détection quantitative des concentrations d'inhibiteurs de RNase dans les échantillons. La microplaque est pré-enduite d'anticorps anti-inhibiteurs de RNase. Les inhibiteurs de RNase présents dans l'échantillon se lient aux anticorps immobilisés sur les puits. Un anticorps anti-inhibiteurs de RNase biotinylé est ensuite ajouté et se lie aux inhibiteurs de RNase présents dans l'échantillon. Après lavage, la streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) est introduite pour se lier à l'anticorps anti-inhibiteurs de RNase biotinylé. Après incubation, la streptavidine-HRP non liée est éliminée par lavage. Une solution de substrat TMB est ensuite ajoutée et catalysée par la HRP pour générer un produit bleu, qui devient jaune après ajout d'une solution d'arrêt acide. L'intensité de la coloration jaune est directement proportionnelle à la concentration d'inhibiteurs de RNase dans l'échantillon. L'absorbance (valeur DO) est mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques, et la concentration d'inhibiteur de RNase dans l'échantillon est calculée sur la base d'une courbe standard.
Composants
| Composants | 48T | 96T |
| Microplaque ELISA | 8×6 | 8×12 |
| Anticorps de détection biotinylé (100x) | 60 µL | 120 µL |
| HRP-streptavidine (100x) | 60 µL | 120 µL |
| Tampon de dilution | 25 mL | 50 mL |
| solution de substrat TMB | 6 mL | 12 mL |
| Solution d'arrêt | 3 mL | 6 mL |
| Tampon de lavage concentré (10x) | 25 mL | 50 mL |
| Standard (0,1 mg/mL) | 25 µL | 50 µL |
| Scelleuse de plaques | 2 pièces | 4 pièces |
Stockage
- La solution étalon (0,1 mg/mL) du kit doit être conservée entre -25 et -15 °C, tandis que les autres composants doivent être conservés entre 2 et 8 °C. Pour garantir la stabilité du stockage, éviter toute exposition à une forte lumière. La durée de conservation est de 12 mois.
- Pour les kits usagés : une fois la microplaque ouverte, veuillez recouvrir les puits non utilisés avec le film étirable et remettre le kit dans le sachet aluminium contenant le sachet déshydratant. Refermez hermétiquement le sachet et conservez-le à une température de 2 à 8 °C dès que possible après utilisation. Les autres réactifs doivent également être conservés à une température de 2 à 8 °C dès que possible après utilisation.
Matériaux nécessaires mais non fournis
- Lecteur de microplaques avec filtre 450±10 nm (idéalement capable de détecter aux longueurs d'onde de 450 et 650 nm).
- Agitateur de microplaques.
Instructions
Avant de commencer
1. Avant utilisation, amener tous les composants du kit et les échantillons à température ambiante (18-25 °C). Si le kit n'est pas utilisé en une seule fois, veuillez ne prélever que les bandelettes et les réactifs nécessaires à l'expérience en cours et conserver les autres bandelettes et réactifs dans les conditions requises.
2. Tampon de lavage : diluer 50 mL de tampon de lavage concentré 10× avec 450 mL d'eau déionisée ou distillée pour préparer 500 mL de tampon de lavage 1×.
3. Étalon : Diluer le concentré étalon (0,1 mg/mL) avec le tampon de dilution aux concentrations suivantes : 128 ng/mL, 64 ng/mL, 32 ng/mL, 16 ng/mL, 8 ng/mL, 4 ng/mL, 2 ng/mL et 0 ng/mL. Nous recommandons de diluer les étalons selon le tableau suivant :
| Non. | Conversation finale. (pg/μL) | Instructions de dilution | |
| tampon STE | Standard | ||
| 1000 | 198 µL | 2 μL de solution standard à 0,1 mg/mL | |
| UN | 128 | 436 µL | 64 μL 1000 ng/mL |
| B | 64 | 250 µL | 250 μL de solution A |
| C | 32 | 250 µL | 250 μL de solution B |
| D | 16 | 250 µL | 250 μL de solution C |
| ET | 8 | 250 µL | 250 μL de solution D |
| F | 4 | 250 µL | 250 μL de solution E |
| G | 2 | 250 µL | 250 μL de solution F |
| H | 0 | 250 µL | / |
4. Anticorps de détection biotinylé et solution de travail HRP-streptavidine : centrifuger brièvement la solution mère avant utilisation. Diluer à la concentration de travail avec le tampon de dilution.
5. Substrat TMB : prélever la dose nécessaire de solution à l’aide d’embouts stérilisés et ne pas remettre la solution restante dans le flacon. Le substrat TMB est photosensible ; ne pas l’exposer à la lumière de façon prolongée.
Utilisation du protocole
- Déterminez le nombre de bandelettes nécessaires pour le test. Insérez les bandelettes dans les cadres pour utilisation. Les bandelettes restantes non utilisées pour ce test doivent être remises dans le sachet contenant le dessiccant. Fermez hermétiquement le sachet pour conservation au réfrigérateur.
- Ajouter 100 µL de chaque dilution (étalon, blanc et échantillon) dans les puits correspondants. Recouvrir avec le film plastique. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation à 500 tr/min. * Si la concentration d'inhibiteur de RNase dans l'échantillon ne peut être déterminée, il est recommandé d'utiliser le tampon de dilution pour effectuer des dilutions successives et déterminer le facteur de dilution à partir du résultat de la première dilution. Une fois le facteur de dilution déterminé, diluer l'échantillon avec le tampon de dilution avant le test. S'assurer que les valeurs calculées à partir de la courbe d'étalonnage se situent dans la plage de linéarité (2-128 ng/mL).
- Étape de lavage : Aspirer la solution et laver avec 300 µL de tampon de lavage dans chaque puits. Laisser agir 15 à 30 secondes. Éliminer complètement le tampon de lavage en tapotant la plaque sur du papier absorbant. Répéter le lavage 3 fois.
- Ajouter 100 µL de solution de travail d'anticorps de détection biotinylé dans chaque puits. Recouvrir avec le film scellant. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation à 500 tr/min.
- Répétez l'étape de lavage.
- Ajouter 100 µL de solution de travail HRP-streptavidine dans chaque puits. Recouvrir d'un film plastique. Incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation à 500 tr/min.
- Répétez l'étape de lavage. 8. Ajoutez 100 µL de solution de substrat TMB dans chaque puits. Recouvrez avec le film plastique. Incubez à 37 °C à l'obscurité pendant 10 minutes. Le liquide deviendra bleu suite à l'ajout de la solution de substrat.
- Ajouter 50 µL de solution d'arrêt dans chaque puits. Le liquide deviendra jaune. Lancer ensuite le lecteur de microplaques et effectuer immédiatement la mesure à 450 nm.
Calcul des résultats
- Calculer la valeur moyenne d'absorption lumineuse de l'étalon, du témoin négatif et de l'échantillon. La courbe d'étalonnage est tracée avec la concentration de l'étalon en abscisse (X) et sa valeur moyenne d'absorption lumineuse en ordonnée (Y). (En mode de détection à deux longueurs d'onde, l'absorption lumineuse est de 450 nm moins 650 nm).
- Il est recommandé d'effectuer le calcul avec un logiciel d'ajustement de courbes informatisé tel que curve expert 1.3 ou ELISA Calc dans un modèle d'ajustement non linéaire à 4 paramètres.
Performance
- Limite inférieure de détection :
- Limite inférieure de quantification : 2 ng/mL
- Linéarité : 2-128 ng/mL
- Précision : CV intra-essai ≤ 10 %, CV inter-essai ≤ 15 %
- Récupération : 80 % à 120 %
- Spécificité : seule la reconnaissance spécifique de l'inhibiteur de RNase est prise en compte ; les autres enzymes utilisées dans l'IVT n'interfèrent pas avec les mesures.
Notes
- La température et la durée de la réaction TMB sont des paramètres critiques ; veuillez les contrôler strictement conformément aux instructions.
- Lors du processus de lavage, le liquide de lavage doit tremper dans la plaque pendant 15 à 30 secondes, puis être séché afin d'éliminer complètement les composants adsorbés de manière non spécifique.
- Tous les réactifs doivent être soigneusement mélangés avant utilisation et il convient d'éviter toute erreur lors de l'ajout des échantillons ou des réactifs.
- Si des cristaux se sont formés dans le tampon de lavage concentré (10x), chauffer à 37℃ et mélanger doucement jusqu'à ce que les cristaux soient complètement dissous.
- Évitez d'analyser des échantillons contenant de l'azide de sodium (NaN3), car cela détruira l'activité de la peroxydase de raifort et diminuera la valeur de détection.
- Il est impératif de ne pas mélanger différents lots de réactifs. De plus, les embouts de pipettes ne doivent pas être interchangés afin d'éviter toute contamination croisée.
- Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants pour les manipulations expérimentales.
- Ce produit est destiné exclusivement à la recherche et ne doit pas être utilisé à des fins de diagnostic médical clinique ni à d'autres fins irrationnelles.