RobuDirect Probe RT-qPCR Premix plus-UNG HYA438
détails du produit
Le prémélange RT-qPCR 2x One-Step RT-qPCR Premix-UNG est un réactif dédié aux réactions qualitatives et quantitatives utilisant la méthode de RT-PCR quantitative en une étape avec sonde fluorescente. Ce produit utilise des enzymes d'amplification d'ADN modifiées par des anticorps à haute affinité et des transcriptases inverses à démarrage à chaud. Grâce à une optimisation poussée du tampon, il permet un prémélange complet des enzymes, du tampon et des amorces/sondes, garantissant ainsi la stabilité du produit final lors d'un stockage prolongé à basse température et facilitant son utilisation. Le réactif intègre un système anti-contamination dUTP/UNG, prévenant efficacement les faux positifs dus aux résidus de produits PCR et à la contamination par aérosols, et assurant ainsi des résultats précis.
Composants
1. Mélange 25×RTase/UNG
2. Tampon de prémélange 2×RT (dUTP)
Stockage
Conserver à -20 °C pour une conservation prolongée ; à 4 °C pendant 3 mois maximum. Bien mélanger avant utilisation et éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
Instructions
1. Préparation du système de réaction qRT-PCR
| Composants | Volume de 25 µL | Volume de 50 µL | Concentration finale |
| Tampon de prémélange 2× RT (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| Mélange RTase/UNG 25× | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mélange amorce-sonde 25×* | 1 µL | 2 µL | 1× |
| ARN matrice** | —— | —— | —— |
| ddH2LE | À 25 µL | À 50 µL | —— |
En général, une concentration finale d'amorces de 0,2 μM donne de bons résultats ; en cas de faible performance, la concentration d'amorces peut être ajustée entre 0,2 et 1 μM. La concentration de sonde est généralement optimale entre 0,1 et 0,3 μM. Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées pour déterminer la combinaison optimale d'amorces et de sondes.
**Différents types de matrices d'ARN contiennent différents nombres de copies du gène cible ; si nécessaire, des dilutions en série peuvent être effectuées pour déterminer la quantité optimale de matrice d'ARN ajoutée.
2. Programme de réaction
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Transcription inverse | 50℃ | 5 à 10 min | 1 |
| Prédénaturation | 95℃ | 30 secondes à 1 minute | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 10-20 s | 40-50 |
| Recuit et extension | 56~64℃ | 20-60 s |
* L'enzyme TS-UNG thermosensible contenue dans ce produit peut effectuer la digestion à température ambiante et devenir inactive pendant le processus de transcription inverse.
Contrôle de qualité
1. Détection fonctionnelle : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qRT-PCR.
2. Absence d'activité nucléasique exogène : absence de pollution par des endonucléases et des exonucléases exogènes.
Informations techniques
1. Ce système contient l'enzyme TS-UNG, qui dégrade les matrices d'ADN contenant de l'uracile à température ambiante ou à 25 °C et est inactivée pendant la transcription inverse, n'affectant ainsi pas l'amplification PCR ultérieure utilisant l'ADNc comme matrice.
2. Ce système utilise généralement une température de 50 °C pour la transcription inverse, mais celle-ci peut être optimisée entre 42 °C et 55 °C. Selon les caractéristiques de la réaction, la durée de la transcription inverse peut être optimisée entre 5 et 30 minutes.
3. La nouvelle transcriptase inverse utilisée dans ce système est une version génétiquement modifiée de M-MLV, lui conférant une tolérance à la température et une température de transcription inverse plus élevées, ce qui se traduit par une efficacité de transcription inverse plus élevée pour les matrices d'ARN complexes.
4. Ce système présente une bonne stabilité et une grande applicabilité, ce qui le rend idéal pour la détection de virus et de matrices d'ARN complexes extraites de tissus. Il offre des résultats d'amplification plus stables, même à des concentrations de matrice extrêmement faibles, ce qui le rend compatible avec une utilisation avec des réactifs de diagnostic moléculaire à haute sensibilité.
5. Pour les amorces avec des températures d'hybridation plus basses ou l'amplification de fragments de plus de 200 pb, une méthode en trois étapes est recommandée.
6. L'efficacité d'utilisation du dUTP et la sensibilité aux enzymes UNG varient selon les gènes à amplifier. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système de réaction doit être ajusté et optimisé. Veuillez contacter notre société pour obtenir une assistance technique.
7. Veuillez utiliser des zones et des pipettes dédiées avant et après l'amplification, porter des gants pendant la manipulation et les changer fréquemment. Ne pas ouvrir le tube de réaction après la fin de la réaction PCR afin de minimiser la contamination de l'échantillon par le produit de PCR.
8. Afin d'éviter l'amplification de produits PCR résiduels, une zone expérimentale et une pipette dédiées sont nécessaires pour l'amplification. Manipulez avec des gants, changez-les fréquemment et ne pas ouvrir le tube PCR après l'amplification.