Transcriptase inverse RTL (sans glycérol, haute densité) HYB213
La transcriptase inverse RTL est une ADN polymérase dépendante de l'ARN, dépourvue d'activité exonucléase 3'→5' et possédant une activité RNase H. Cette enzyme utilise l'ARN comme matrice pour synthétiser un brin d'ADN complémentaire, ce qui permet la synthèse d'ADNc de premier brin, notamment pour la RT-LAMP. La transcriptase inverse RTL (sans glycérol) peut être utilisée pour la préparation de réactifs lyophilisés, tels que des réactifs RT-LAMP lyophilisés.
Composants
| Composants | 1500U | 15000U | 150000U |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol, haute densité) (75 U/μL) | 0,02 mL | 0,2 mL | 2 mL |
| Tampon RTL 10 × HH | 1,5 mL | 4 x 1,5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 mL | 2 x 1,5 mL | 3 × 10 mL |
Stockage
À conserver entre -25 et -15 °C, valable 18 mois.
Définition de l'unité
Une unité incorpore 1 nmol de dTTP dans un matériau précipitable à l'acide en 20 minutes à 50 °C en utilisant du poly(A)•oligo(dT)25 comme matrice-amorce.
Contrôle de qualité
1. Activité résiduelle de l'endonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ et 15 unités de RTL incubée pendant 16 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
2. Activité résiduelle de l'exonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ digéré par Hind III et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
3. Activité résiduelle de la nickase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg de pBR322 superenroulé et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37ºC montre le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
4. Activité résiduelle de la RNase :Une réaction de 10 µL contenant 0,48 µg d'ARN MS2 et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
5. E. coli ADN génomique :Mesuré avec E. coli kits de détection HCD spécifiques, 15 unités de RTL contiennent moins de 1 E. coli génome.
Système de réaction de transcription inverse
| Composant | Volume |
| ARN matrice | facultatif |
| Oligo(dT)18~25 (50 μM) ou mélange d'amorces aléatoires (60 μM) | 2 μL |
| mélange de dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol, haute densité) (75 U/μL) | 0,5 μL |
| Tampon RTL 10 x HH | 2 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
Remarque : La dose recommandée d’ARN total est de 1 ng à 1 µg. La dose recommandée d’ARNm est de 50 ng à 100 ng.
Réaction programme
| Température | Temps |
| 25 °C* | 5 min |
| 55 °C | 10 min** |
| 80 °C | 10 min |
*Si un mélange d'amorces aléatoires est utilisé, une étape d'incubation à 25 °C.
**Si un mélange d'amorces cibles est utilisé, une étape d'incubation à 55°C pendant 10 à 30 minutes.
RT-LAMPsystème de réaction
| Composant | Volume | Concentration finale |
| ARN matrice* | facultatif | ≥10 exemplaires |
| Mélange de dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Amorces FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Amorces F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Amorce LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL | 20U/Rxn |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol, haute densité) (75 U/μL) | 0,1 μL | 7,5 U |
| ADN polymérase Bst 2.0 (8 U/μL) | 1 μL | 8 U |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 x HH RTL Buffer / 10 x HH Bst 2.0 Buffer | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 25 μL | - |
Mélanger par agitation douce et centrifuger brièvement pour recueillir. Incuber à température constante entre 60 °C et 65 °C pendant 1 heure.
Notes
1. Ce produit se solidifie en un solide blanc lorsqu'il est conservé à -20 °C. Sortez-le du congélateur et placez-le sur de la glace pendant environ 10 minutes. Après fonte, il peut être utilisé en agitant et en mélangeant.
2. Le produit d'ADNc peut être conservé à -20 °C ou -80 °C ou utilisé immédiatement pour la PCR.
3. Afin de prévenir toute contamination par la RNase, veuillez maintenir la zone expérimentale propre et porter des gants et un masque propres pendant la manipulation.