Transcriptase inverse RTL (sans glycérol) HYB212
La transcriptase inverse RTL est une ADN polymérase dépendante de l'ARN, dépourvue d'activité exonucléase 3'→5' et possédant une activité RNase H. Cette enzyme utilise l'ARN comme matrice pour synthétiser un brin d'ADN complémentaire, ce qui permet la synthèse d'ADNc de premier brin, notamment pour la RT-LAMP. La transcriptase inverse RTL (sans glycérol) peut être utilisée pour la préparation de réactifs lyophilisés, tels que des réactifs RT-LAMP lyophilisés.
Composants
| Composants | 1500U | 15000U | 150000U |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol) (15 U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| Tampon RTL 10 × HH | 1,5 mL | 4 x 1,5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 mL | 2 × 1,5 mL | 3 × 10 mL |
Stockage
À conserver entre -25 et -15 °C, valable 18 mois.
Définition de l'unité
Une unité incorpore 1 nmol de dTTP dans un matériau précipitable à l'acide en 20 minutes à 50 °C en utilisant du poly(A)•oligo(dT)25 comme matrice-amorce.
Contrôle de qualité
1. Activité résiduelle de l'endonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ et 15 unités de RTL incubée pendant 16 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
2. Activité résiduelle de l'exonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ digéré par Hind III et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
3. Activité résiduelle de la nickase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg de pBR322 superenroulé et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37ºC montre le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
4. Activité résiduelle de la RNase :Une réaction de 10 µL contenant 0,48 µg d'ARN MS2 et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
5. E. coliADN génomique :Mesuré avec E. coli kits de détection HCD spécifiques, 15 unités de RTL contiennent moins de 1 E. coli génome.
Système de réaction de transcription inverse
| Composant | Volume |
| ARN matrice | facultatif |
| Oligo(dT)18~25 (50 μM) ou mélange d'amorces aléatoires (60 μM) | 2 μL |
| mélange de dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol) (15 U/μL) | 0,5 μL |
| Tampon RTL 10 x HH | 2 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
Remarque : La dose recommandée d’ARN total est de 1 ng à 1 µg. La dose recommandée d’ARNm est de 50 ng à 100 ng.
Réaction programme
| Température | Temps |
| 25 °C* | 5 min |
| 55 °C | 10 min** |
| 80 °C | 10 min |
*Si un mélange d'amorces aléatoires est utilisé, une étape d'incubation à 25 °C.
**Si un mélange d'amorces cibles est utilisé, une étape d'incubation à 55°C pendant 10 à 30 minutes.
RT-LAMPsystème de réaction
| Composant | Volume | Concentration finale |
| ARN matrice* | facultatif | ≥10 exemplaires |
| Mélange de dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Amorces FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Amorces F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Amorce LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL | 20U/Rxn |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol) (15 U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U |
| ADN polymérase Bst 2.0 (8 U/μL) | 1 μL | 8 U |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 x HH RTL Buffer / 10 x HH Bst 2.0 Buffer | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 25 μL | - |
Mélanger par agitation douce et centrifuger brièvement pour recueillir. Incuber à température constante entre 60 °C et 65 °C pendant 1 heure.
Notes
1. Ce produit se solidifie en un solide blanc lorsqu'il est conservé à -20 °C. Sortez-le du congélateur et placez-le sur de la glace pendant environ 10 minutes. Après fonte, il peut être utilisé en agitant et en mélangeant.
2. Le produit d'ADNc peut être conservé à -20°C ou -80°C ou utilisé immédiatement pour la PCR.
3. Afin de prévenir toute contamination par la RNase, veuillez maintenir la zone expérimentale propre et porter des gants et des masques propres pendant l'opération.