Mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG HYA413
Ce produit est un réactif SYBR Green universel, compatible avec tous les types d'instruments de PCR quantitative par fluorescence du marché, y compris ceux nécessitant une quantité élevée de ROX, une quantité faible de ROX ou aucun ROX. Il utilise un colorant de référence spécifique (ROX) pour une résolution et une sensibilité accrues. Le mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG intègre un système dUTP/UDG qui prévient l'impact de la contamination par le produit d'amplification sur la qPCR et garantit la précision des résultats. L'UDG dégrade rapidement les polluants contenant de l'uranium à température ambiante et se désactive rapidement après prédénaturation à 95 °C, sans affecter l'efficacité ni la sensibilité de la qPCR. L'amplification est réalisée avec une ADN polymérase Taq à démarrage à chaud, ce qui renforce la spécificité du produit. En résumé, ce produit constitue une solution fiable et polyvalente pour les expériences de qPCR basées sur le SYBR Green.
Composants
| Composants | 1 mL | 5 mL | 25 mL |
| Mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG* | 1 mL | 5 × 1 mL | 25 × 1 mL |
*Y compris la Taq ADN polymérase Hot Start, Mg2+, dNTP, SYBR®Vert I, teinture ROX universelle.
Instruments
Aucun colorant de référence supplémentaire n'est requis. Le mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG convient à tous les instruments qPCR (y compris les machines en mode ROX élevé, en mode ROX faible et en mode sans ROX requis).
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Matériel requis
1. Tubes PCR et autres matériels connexes.
2. Amorce spécifique qPCR et matrices d'ADN.
3. Plaque qPCR 96 puits et membrane de scellage (film adhésif).
Notes
1. Mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG : l’UDG doit être complètement décongelé avant utilisation. Protéger de la lumière directe et conserver à l’abri de la lumière.
2. Le mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG contient du glycérol. Bien mélanger avant utilisation pour éviter la formation de bulles ; vortexer et centrifuger avant utilisation. Conserver immédiatement à -20 °C après utilisation.
3. Ce produit contient de l'ADN polymérase. À conserver sur glace pendant toute la durée d'utilisation. Pour une utilisation répétée de courte durée (au cours d'une même journée), un stockage temporaire à 4 °C est autorisé. Limiter les cycles de congélation-décongélation.
Instructions
1. Préparation expérimentale
1. Il est recommandé de choisir la longueur du produit d'amplification dans la plage de 70 à 200 pb.
2. Il est recommandé de prendre un volume réactionnel de 20 μL, d'ajouter 1 pg-50 ng d'ADN comme matrice et de définir un NTC (contrôle sans matrice).
3. Pour garantir la précision expérimentale, effectuez des réplicats techniques en triple pour tous les échantillons et les contrôles.
2. qPCR RréactionSystème
| Composants | Volume |
| Mélange SYBR Green Fast qPCR avec UDG* | 10 µL |
| Amorce directe (10 µM)* | 0,4 µL |
| Amorce inverse (10 μM)* | 0,4 µL |
| Modèle d'ADN** | 2 µL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 µL |
En général, la concentration finale de l'amorce est de 0,2 μM, et de bons résultats sont obtenus. Une concentration finale de 0,1 à 1,0 μM peut servir de référence pour définir la plage de concentrations optimales. En cas de faible efficacité d'amplification, la concentration des amorces peut être augmentée. Si des réactions non spécifiques se produisent, la concentration des amorces peut être réduite et le système réactionnel optimisé.
En utilisant 10 pg à 10 ng d'ADN génomique ou 10 pg à 100 ng d'ADNc comme quantité de référence, une dilution en gradient peut être réalisée afin de déterminer la quantité optimale de matrice, compte tenu du nombre variable de copies des gènes cibles dans les matrices de différentes espèces. De plus, lors de l'utilisation d'ADNc (solution de réaction RT) issu d'une réaction RT-qPCR en deux étapes comme matrice, la quantité ajoutée ne doit pas dépasser 10 % du volume du système réactionnel qPCR.
3. qPCR RProgramme d'action
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Réaction UDG | 37 °C | 2 min | 1 |
| Prédénaturation | 95 °C | 3 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 5 s | 40 |
| Recuit et extension | 60℃ | 30-34 s* | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
* Vérifiez qu'une étape de collecte de signal est effectuée après chaque étape d'extension. La durée de cette étape varie selon les machines : 30 s pour StepOne Plus, 31 s pour 7300 et 34 s pour 7500. Sauf indication contraire, la durée par défaut est de 30 s.
Données Analyse
1. Tracer la courbe d'étalonnage à partir des valeurs Ct et de la quantité d'échantillon. Le coefficient de corrélation (R²) de la courbe d'étalonnage doit être supérieur à 0,98, avec une pente comprise entre -3 et -3,5. L'efficacité d'amplification par PCR (E) se situe généralement entre 90 et 120 %.
2. L'écart type (STD) des valeurs Ct entre les puits répliqués doit être
3. La courbe de fusion du produit d'amplification ne présente aucun pic significatif de produits d'amplification non spécifiques (pics non spécifiques) ni de dimères d'amorces (à confirmer par électrophorèse sur gel d'agarose si nécessaire). De plus, la température de fusion (Tm) se situe généralement entre 80 et 95 °C.
4. Validation d'un Ct valide : Une valeur Ct d'amplification valide doit être inférieure à la valeur Ct de la courbe de contrôle sans matrice, tandis que sa courbe de fusion ne doit pas présenter de pics non spécifiques.