Prémélange SYBR Green Fast qPCR HYA411
La PCR quantitative en temps réel est une technique utilisant des colorants double brin d'ADN, généralement le SYBR®Le Green I permet de détecter quantitativement la quantité initiale d'ADN par amplification. Le SYBR Green Fast qPCR Premix est un réactif de fluorescence pour les réactions qPCR utilisant le SYBR Green.®Vert I. Ce produit fournit des données en temps réel sur l'amplification de l'ADN pendant la PCR en effectuant une détection quantitative du signal de fluorescence sur SYBR®Ce produit utilise l'enzyme Taq polymérase à démarrage à chaud, basée sur des anticorps, pour l'amplification, ce qui améliore considérablement sa spécificité tout en garantissant son efficacité. De plus, grâce à l'optimisation du système de tampon de mélange qPCR, il convient à de nombreuses espèces et constitue un outil puissant pour les expériences multidisciplinaires. Ce produit est un mélange enzymatique 2X pré-mélangé contenant tous les composants nécessaires à la qPCR, à l'exception des amorces et des matrices, ce qui simplifie grandement les manipulations expérimentales.
Composants
| Composants | 1 mL | 5 mL | 25 mL |
| Prémélange SYBR Green Fast qPCR* | 1 mL | 1 mL × 5 | 1 mL × 25 |
| Colorant de référence ROX 50X I | 40 μL | 200 μL | 200 μL × 5 |
| Colorant de référence ROX 50X II | 40 μL | 200 μL | 200 μL × 5 |
*Y compris la Taq ADN polymérase Hot Start, Mg2+, dNTP, SYBR®Vert I, etc.
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Matériel requis
1. Tubes PCR et autres matériels connexes.
2. Amorce spécifique qPCR et matrices d'ADN.
3. Plaque qPCR 96 puits et membrane de scellage (film adhésif).
Notes
1. Le prémélange SYBR Green Fast qPCR doit être complètement décongelé avant utilisation. À protéger de la lumière directe et à conserver à l'abri de la lumière.
2. Le prémélange SYBR Green Fast qPCR contient du glycérol. Bien mélanger avant utilisation pour éviter la formation de bulles ; vortexer et centrifuger avant utilisation. Conserver immédiatement à -20 °C après utilisation.
3. Ce produit contient de l'ADN polymérase. À conserver sur glace pendant toute la durée d'utilisation. Pour une utilisation répétée de courte durée (au cours d'une même journée), un stockage temporaire à 4 °C est autorisé. Limiter les cycles de congélation-décongélation.
Instruments
1. Préparation expérimentale
1. Il est recommandé de choisir la longueur du produit d'amplification dans la plage de 70 à 200 pb.
2. Il est recommandé de prendre un volume réactionnel de 20 μL, d'ajouter 1 pg-50 ng d'ADN comme matrice et de définir un NTC (contrôle sans matrice).
3. Pour garantir la précision expérimentale, effectuez des réplicats techniques en triple pour tous les échantillons et les contrôles.
4. La concentration du colorant de référence ROX varie selon les instruments. Veuillez vous référer au tableau ci-dessous pour savoir s'il faut l'ajouter ou non.
| Types de Rox | Machines qPCR |
| Pas de ROX | Bio-Rad iCycler, Roche LightCycler, Qiagen/Corbett et autres |
| Colorant de référence ROX 50X I | ABI 7000/7300/7700/7900, ABI StepOne/StepOnePlus, Eppendorf et autres |
| Colorant de référence ROX 50X II | ABI 7500, ABI ViiATM7, ABI QuantaStudio, Stratagene, Corbett Rotor Gene 3000 et autres |
2. qPCR Rréactionsystème
| Composants | Volume |
| Prémélange SYBR Green Fast qPCR | 10 µL |
| Amorce directe (10 µM)** | 0,4 µL |
| Amorce inverse (10 µM)** | 0,4 µL |
| ADN génomique ou ADNc* | 2 µL |
| ROX I / II (si nécessaire, sélectionner en fonction du modèle d'instrument) | 0,4 µL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 µL |
En général, la concentration finale de l'amorce est de 0,2 μM, et de bons résultats sont obtenus. Une concentration finale de 0,1 à 1,0 μM peut servir de référence pour définir la plage de concentrations optimales. En cas de faible efficacité d'amplification, la concentration des amorces peut être augmentée. Si des réactions non spécifiques se produisent, la concentration des amorces peut être réduite et le système réactionnel optimisé.
En utilisant 10 pg à 10 ng d'ADN génomique ou 10 pg à 100 ng d'ADNc comme quantité de référence, une dilution en gradient peut être effectuée sur la matrice afin de déterminer la quantité optimale, compte tenu du nombre variable de copies des gènes cibles dans les matrices de différentes espèces. De plus, lors de l'utilisation d'ADNc (solution de réaction RT) issu d'une réaction RT-qPCR en deux étapes comme matrice, la quantité ajoutée ne doit pas dépasser 10 % du volume du système réactionnel qPCR.
3. qPCR RréactionProgramme
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Prédénaturation | 95 °C | 3 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 5 s | 40-45 |
| Recuit et extension | 60℃ | 30-34 s* | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
* Vérifiez qu'une étape de collecte de signal est effectuée après chaque étape d'extension. La durée de cette étape varie selon les machines : 30 s pour StepOne Plus, 31 s pour 7300 et 34 s pour 7500. Sauf indication contraire, la durée par défaut est de 30 s.