Prémélange SYBR Green qPCR HYA412
La PCR quantitative en temps réel (qPCR) est une technique puissante permettant de détecter l'ADN initial dans une réaction PCR par accumulation du signal de fluorescence. Le colorant lié à l'ADN double brin, SYBR®Le colorant vert I est le plus couramment utilisé en qPCR. Le prémélange SYBR Green qPCR contient un colorant de référence universel de conception nouvelle, permettant une résolution de signal supérieure et compatible avec tous les instruments de qPCR actuellement utilisés (y compris les appareils fonctionnant en mode ROX élevé, ROX faible et sans ROX). Il contient également la Taq polymérase Hot-Start afin d'éviter les résultats d'amplification inattendus. De plus, le prémélange SYBR Green qPCR est un mélange réactionnel optimisé pour la qPCR. Il contient tous les composants nécessaires, à l'exception des amorces et de la matrice. Il est facile à utiliser et convient à de nombreuses espèces. Ces caractéristiques en font un outil idéal pour la recherche quantitative sur les gènes.
Composants
| Composants | 1 mL | 5 mL | 25 mL |
| Prémélange SYBR Green qPCR* | 1 mL | 5 × 1 mL | 25 × 1 mL |
*Y compris la Taq ADN polymérase Hot Start, Mg2+, dNTP, SYBR® Green I, colorant ROX universel, etc.
Instruments
Aucun colorant de référence supplémentaire n'est requis. Le prémélange SYBR Green qPCR convient à tous les instruments qPCR actuellement utilisés (y compris les appareils en mode ROX élevé, ROX faible et sans ROX requis).
Stockage
Ce produit doit être conservé à -20℃ pour un stockage à long terme et doit être protégé de la lumière.
Matériel requis
1. Tubes PCR et autres matériels connexes.
2. Amorce spécifique qPCR et matrices d'ADN.
3. Plaque qPCR 96 puits et membrane de scellage (film adhésif).
Notes
1. Le prémélange SYBR Green qPCR doit être complètement décongelé avant utilisation. À protéger de la lumière directe et à conserver à l'abri de la lumière.
2. Le prémélange SYBR Green qPCR contient du glycérol. Bien mélanger avant utilisation pour éviter la formation de bulles ; vortexer et centrifuger avant utilisation. Conserver immédiatement à -20 °C après utilisation.
3. Ce produit contient de l'ADN polymérase. À conserver sur glace pendant toute la durée d'utilisation. Pour une utilisation répétée de courte durée (au cours d'une même journée), un stockage temporaire à 4 °C est autorisé. Limiter les cycles de congélation-décongélation.
Instructions
1. Préparation expérimentale
1. Il est recommandé de choisir la longueur du produit d'amplification dans la plage de 70 à 200 pb.
2. Il est recommandé de prendre un volume réactionnel de 20 μL, d'ajouter 1 pg-50 ng d'ADN comme matrice et de définir un NTC (contrôle sans matrice).
3. Pour garantir la précision expérimentale, effectuez des réplicats techniques en triple pour tous les échantillons et les contrôles.
2. qPCR RréactionSystème
| Composants | Volume |
| Prémélange SYBR Green qPCR | 10 µL |
| Amorce directe (10 µM)* | 0,4 µL |
| Amorce inverse (10 μM)* | 0,4 µL |
| ADN génomique ou ADNc** | 2 µL |
| ddH2LE | Jusqu'à 20 µL |
En général, la concentration finale de l'amorce est de 0,2 μM, et de bons résultats sont obtenus. Une concentration finale de 0,1 à 1,0 μM peut servir de référence pour définir la plage de concentrations optimales. En cas de faible efficacité d'amplification, la concentration des amorces peut être augmentée. Si des réactions non spécifiques se produisent, la concentration des amorces peut être réduite et le système réactionnel optimisé.
En utilisant 10 pg à 10 ng d'ADN génomique ou 10 pg à 100 ng d'ADNc comme quantité de référence, une dilution en gradient peut être réalisée afin de déterminer la quantité optimale de matrice, compte tenu du nombre variable de copies des gènes cibles dans les matrices de différentes espèces. De plus, lors de l'utilisation d'ADNc (solution de réaction RT) issu d'une réaction RT-qPCR en deux étapes comme matrice, la quantité ajoutée ne doit pas dépasser 10 % du volume du système réactionnel qPCR.
3. qPCR RProgramme d'action
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Prédénaturation | 95 °C | 3 min | 1 |
| Dénaturation | 95 °C | 5 s | 40-45 |
| Recuit et extension | 60℃ | 30-34 s* | |
| Courbe de fusion | Par défaut de l'instrument | / | 1 |
* Vérifiez qu'une étape de collecte de signal est effectuée après chaque étape d'extension. La durée de cette étape varie selon les machines : 30 s pour StepOne Plus, 31 s pour 7300 et 34 s pour 7500. Sauf indication contraire, la durée par défaut est de 30 s.
Données Analyse
1. Tracer la courbe d'étalonnage à partir des valeurs Ct et de la quantité d'échantillon. Le coefficient de corrélation (R²) de la courbe d'étalonnage doit être supérieur à 0,98, avec une pente comprise entre -3 et -3,5. L'efficacité d'amplification par PCR (E) se situe généralement entre 90 et 120 %.
2. L'écart type (STD) des valeurs Ct entre les puits répliqués doit être
3. La courbe de fusion du produit d'amplification ne présente aucun pic significatif de produits d'amplification non spécifiques (pics non spécifiques) ni de dimères d'amorces (à confirmer par électrophorèse sur gel d'agarose si nécessaire). De plus, la température de fusion (Tm) se situe généralement entre 80 et 95 °C.
4. Validation d'un Ct valide : Une valeur Ct d'amplification valide doit être inférieure à la valeur Ct de la courbe de contrôle sans matrice, tandis que sa courbe de fusion ne doit pas présenter de pics non spécifiques.