Kit ELISA de l'ARN polymérase T7 (version à oscillation) - HYJ523
Ce kit utilise la méthode du double sandwich d'anticorps : la plaque de microtitration est pré-enduite d'anticorps anti-ARN polymérase T7. L'échantillon est ajouté et incubé avec un anticorps marqué à la peroxydase de raifort (HRP) pour former un complexe anticorps-antigène-anticorps marqué à l'enzyme. Après lavage, une solution de substrat TMB est ajoutée et catalysée par la HRP pour produire un produit de couleur bleue qui vire au jaune après ajout d'une solution d'arrêt acide. L'intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration d'ARN polymérase T7 dans l'échantillon. L'absorbance (DO) est mesurée à 450 nm.
Composants
| Composants | 48T | 96T |
| Microplaque ELISA | 8×6 | 8×12 |
| Concentré standard (0,1 mg/ml) | 0,025 mL | 0,05 mL |
| Conjugué enzymatique (100×) | 0,03 mL | 0,06 mL |
| Tampon de dilution d'échantillon | 15 mL | 30 mL |
| Tampon de dilution du conjugué enzymatique | 3 mL | 6 mL |
| Concentré de lavage (10×) | 15 mL | 30 mL |
| Solution de substrat | 6 mL | 12 mL |
| Solution d'arrêt | 3 mL | 6 mL |
| Scelleuse de plaques | 2 pièces | 4 pièces |
Stockage
Le kit non ouvert doit être conservé entre 2 et 8 °C pour une durée de conservation optimale.
Matériaux nécessaires mais non fournis
Lecteur de microplaques avec filtre 450±10 nm (idéalement capable de détecter aux longueurs d'onde de 450 et 650 nm).
Agitateur de microplaques.
Instructions
Avant de commencer
1. Amener tous les réactifs à température ambiante (23℃±2℃) avant utilisation.
2. Diluer le liquide de lavage concentré 10 fois avec de l'eau purifiée selon un rapport volumique de 1:9 pour obtenir le liquide de lavage de travail.
3. Diluer le concentré standard (0,1 mg/mL) avec le tampon de dilution d'échantillon aux concentrations suivantes : 32 ng/mL, 16 ng/mL, 8 ng/mL, 4 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0,5 ng/mL et 0 ng/mL. Nous recommandons de diluer les standards selon le tableau suivant :
| Non. | Conversation finale. (pg/μL) | Instructions de dilution | |
| tampon STE | Standard | ||
| 1000 | 198 µL | Concentré standard 2 μL | |
| UN | 32 | 387 µL | 12,8 μL 1000 ng/mL |
| B | 16 | 200 µL | 200 μL de solution A |
| C | 8 | 200 µL | 200 μL de solution B |
| D | 4 | 200 µL | 200 μL de solution C |
| ET | 2 | 200 µL | 200 μL de solution D |
| F | 1 | 200 µL | 200 μL de solution E |
| G | 0,5 | 200 µL | 200 μL de solution F |
| H | 0 | 200 µL | / |
4. Diluer le conjugué enzymatique (100×) à la concentration de travail à l'aide du tampon de dilution du conjugué enzymatique avant utilisation.
Utilisation du protocole
- Déterminez le nombre de bandelettes nécessaires pour le test. Insérez les bandelettes dans les cadres pour utilisation. Les bandelettes restantes non utilisées pour ce test doivent être remises dans le sachet contenant le dessiccant. Fermez hermétiquement le sachet pour conservation au réfrigérateur.
- Il est recommandé de tester les produits standards et les échantillons en utilisant plusieurs puits. Ajouter d'abord 50 µL de solution de conjugué enzymatique 1X par puits, puis 50 µL de l'étalon et de l'échantillon par puits. * Si la concentration de polymérase ARN T7 dans l'échantillon ne peut être déterminée, il est recommandé de le diluer par dilutions successives (4x, 8x, 40x, 200x) à l'aide du diluant, afin de déterminer le facteur de dilution optimal. Une fois ce facteur déterminé, diluer l'échantillon avec le diluant approprié avant de procéder au test. Vérifier que les valeurs calculées à partir de la courbe d'étalonnage se situent dans la plage de linéarité (0,25-32 ng/mL).
- Recouvrir d'un film plastique. Incuber à 37 °C pendant 1 heure sous agitation à 500 tr/min.
- Jetez le liquide et séchez en tapotant avec un torchon propre ou du papier absorbant. Remplissez chaque alvéole avec 300 µL de liquide de lavage et laissez agir 15 à 30 secondes. Secouez pour éliminer le liquide et séchez en tapotant. Répétez l'opération trois fois.
- Ajouter 100 μL de solution de substrat TMB dans chaque puits. Recouvrir avec le film scellant. Incuber à 37 °C pendant 15 min à l'abri de la lumière.
- Ajouter 50 μL de solution d'arrêt dans chaque puits. Mesurer l'absorbance à 450/650 nm.
Calcul des résultats
- Calculer la valeur moyenne d'absorption lumineuse de l'étalon, du témoin négatif et de l'échantillon. La courbe d'étalonnage est tracée avec la concentration de l'étalon en abscisse (X) et sa valeur moyenne d'absorption lumineuse en ordonnée (Y). (En mode de détection à deux longueurs d'onde, l'absorption lumineuse est de 450 nm moins 650 nm).
- Il est recommandé d'effectuer le calcul avec un logiciel d'ajustement de courbes informatisé tel que curve expert 1.3 ou ELISA Calc dans un modèle d'ajustement non linéaire à 4 paramètres.
Performance
- Limite inférieure de détection :
- Limite inférieure de quantification : 0,25 ng/mL
- Linéarité : 0,25-32 ng/mL
- Précision : CV intra-essai ≤ 10 %, CV inter-essai ≤ 15 %
- Récupération : 80 % à 120 %
- Spécificité : reconnaissance spécifique uniquement de l'ARN polymérase T7, les autres enzymes de l'outil IVT n'interfèrent pas avec les mesures.
Notes
- La température et la durée de la réaction TMB sont des paramètres critiques ; veuillez les contrôler strictement conformément aux instructions.
- Lors du processus de lavage, le liquide de lavage doit tremper dans la plaque pendant 15 à 30 secondes, puis être séché afin d'éliminer complètement les composants adsorbés de manière non spécifique.
- Tous les réactifs doivent être soigneusement mélangés avant utilisation et il convient d'éviter toute erreur lors de l'ajout des échantillons ou des réactifs.
- Si des cristaux se sont formés dans le tampon de lavage concentré (10x), chauffer à 37℃ et mélanger doucement jusqu'à ce que les cristaux soient complètement dissous.
- Évitez d'analyser des échantillons contenant de l'azide de sodium (NaN3), car cela détruira l'activité de la peroxydase de raifort et diminuera la valeur de détection.
- Il est impératif de ne pas mélanger différents lots de réactifs. De plus, les embouts de pipettes ne doivent pas être interchangés afin d'éviter toute contamination croisée.
- Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants pour les manipulations expérimentales.
- Ce produit est destiné exclusivement à la recherche et ne doit pas être utilisé à des fins de diagnostic médical clinique ni à d'autres fins irrationnelles.