ARN polymérase T7 (thermostable) --HYJ213
L'ARN polymérase T7 (thermostable) est adaptée à la transcription in vitro à haute température. À partir d'une matrice d'ADN double brin linéaire contenant la séquence du promoteur T7 et des NTP comme substrats, elle transcrit la séquence d'ADN en aval du promoteur pour produire de l'ARN. Cette enzyme peut également incorporer des nucléotides modifiés pour produire de l'ARN marqué à la biotine, à un colorant ou radioactivement, ou utiliser des structures de coiffage ou des analogues pour produire de l'ARN coiffé. La réaction à haute température contribue à réduire la formation de sous-produits d'ARNdb et minimise l'immunogénicité de l'ARN produit.
Composants
| Composants | 5KU | 50KU | 500KU | 5000KU |
| ARN polymérase T7 (thermostable) 50 U/μL | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL | 100 mL |
| Tampon IVT à haut rendement 10×A | 2 × 0,1 mL | 2 × 1 mL | 2 × 10 mL | 2 × 100 mL |
Stockage
Transporter à une température inférieure à 0 °C ; conserver entre -25 et -15 °C. Durée de conservation : 24 mois.
tampon de stockage
Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, β-mercaptoéthanol 20 mM, EDTA 1 mM, glycérol 50 %, Triton X-100 0,1 % (p/v), pH 7,9 à 25 °C
Système réactionnel et conditions
| Composants | Volume |
| Tampon IVT à haut rendement 10×A | 2 µL |
| ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM chacun) | 2 μL chacun (10 mM chacun final)* |
| Inhibiteurs de RNase | 1 μL (40 U) |
| Pyrophosphatase inorganique | 0,5 μL (0,05U) |
| ARN polymérase T7 (faible concentration d'ARNdb) 50 U/μL | 1 μL |
| ADN modèle linéarisé | 1 μg |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 µL |
Ajoutez les composants de la réaction dans l'ordre indiqué ci-dessus.
Temps de réaction : 37 °C pendant 2 heures, ou 50 °C pendant 1 heure si une réaction à haute température est nécessaire.
Réaction de terminaison :Ajouter 2 µL d'EDTA 0,2 M (pH = 8,0 à 25 °C)
Suppression de la matrice d'ADN : La matrice d'ADN peut être éliminée avec 10U de DNase I et une incubation de 30 min à 37 °C.
Notes
- La réaction de transcription doit être effectuée dans un environnement exempt de contamination par la RNase. Le port de gants est conseillé. Les embouts, les tubes et l'eau doivent être exempts de nucléases.
- L'efficacité de la transcription varie selon les différentes séquences, et des ajustements de gradient peuvent être apportés au système de réaction.
- Le mélange réactionnel de synthèse d'ARN doit être préparé à température ambiante, car l'ADN peut précipiter en présence de tampon IVT 10×Hi-Yield A à 4°C.
- Le rendement en transcrits de longueur appropriée diminue si l'ADN matrice est incomplètement linéarisé.
- La quantité de mélange réactionnel peut être augmentée ou diminuée.
- Les fragments transcrits sont inférieurs ou égaux à 500 pb, et il est recommandé de prolonger la durée de transcription à 4-8 h.
- Des précipités peuvent facilement se former dans le tampon IVT 10×Hi-Yield A après congélation et décongélation. Veuillez vérifier que le tampon IVT 10×Hi-Yield A est complètement dissous avant l'expérience. Si des précipités persistent, redissolvez le tampon IVT 10×Hi-Yield A à 37 °C.