Kit de test universel pour la détection de la protéine A résiduelle - HYI135
Ce kit de dosage permet de détecter la protéine A résiduelle dans les anticorps et les protéines de fusion Fc. Son principe repose sur un dosage immuno-enzymatique de type sandwich, utilisant un tampon acide pour diluer l'échantillon et séparer efficacement la protéine A résiduelle de la fraction Fc de l'échantillon. La procédure est simple. Comme illustré sur la figure 1, la plaque de dosage fournie dans le kit est pré-enduite d'anticorps monoclonaux anti-protéine A. Les solutions étalons et les échantillons de protéine A, dilués en milieu acide, sont directement ajoutés à la plaque pré-enduite. Après une incubation d'une heure à température ambiante sous agitation, les substances non liées sont éliminées par lavage, formant ainsi un complexe « anticorps de revêtement-protéine A » sur la plaque. Des anticorps de détection anti-protéine A biotinylés sont ensuite ajoutés, formant un complexe « anticorps de revêtement-protéine A-anticorps de détection biotinylé ». Après une nouvelle incubation d'une heure à température ambiante, les substances non liées sont éliminées par lavage. On ajoute ensuite le complexe streptavidine-peroxydase de raifort (SA-HRP) et on l'incube à température ambiante pendant 20 minutes, ce qui entraîne la formation d'un complexe « anticorps de revêtement-protéine A-anticorps de détection biotinylé-SA-HRP » sur la plaque de dosage. Après élimination des substances non liées par lavage, on ajoute le substrat TMB. La réaction enzymatique du substrat sur la phase solide génère une réaction colorée. Après environ 6 minutes de développement de la couleur, la réaction est arrêtée. Les résultats sont mesurés à l'aide d'un lecteur ELISA à une longueur d'onde de 450 nm, 650 nm servant de longueur d'onde de référence. Les résultats sont calculés à partir de la différence entre les densités optiques à 450 nm et à 650 nm, qui reflète indirectement la quantité de protéine A liée à la plaque de dosage. La quantité résiduelle de protéine A dans les anticorps et les protéines de fusion Fc peut être analysée quantitativement à partir de la courbe standard.
Caractéristiques du kit
1. Les anticorps de revêtement et de détection sont des anticorps monoclonaux (AcM) produits à partir de lignées cellulaires monoclonales. Ils sont purifiés par chromatographie sur colonne en deux étapes, garantissant ainsi la reproductibilité inter-lots et la disponibilité continue du kit de dosage. Les régions Fc et charpente des deux anticorps ne se lient pas à la protéine A, ce qui confirme la validité scientifique du principe de conception du kit.
2. Le kit est fourni avec un ligand universel de protéine A. Utilisé comme étalon, ce ligand a démontré une bonne capacité de récupération pour divers autres ligands dans des échantillons réels, attestant ainsi de la polyvalence du kit pour de nombreux ligands de protéine A, tant importés que locaux. De plus, le kit inclut quatre ligands de protéine A importés et quatre ligands de protéine A locaux couramment utilisés dans l'industrie. L'utilisateur peut choisir le ligand correspondant à ses besoins. Si un étalon de protéine A non inclus dans le kit est utilisé, il peut être dilué et préparé selon les étapes décrites à la section 6.2 (10) de ce manuel. Des recherches complémentaires sur d'autres ligands de protéine A sont en cours et seront intégrées au kit si nécessaire après évaluation.
3. Le protocole expérimental est simple : il suffit de diluer l’échantillon et de le déposer directement sur la plaque. Il ne comporte aucune étape complexe telle que chauffage, dénaturation, centrifugation ou pré-incubation avant dilution et dépôt. L’expérience dure environ 3 heures.
4. Ce kit offre une sensibilité élevée par rapport aux produits similaires. Le point le plus bas de la courbe d'étalonnage correspond à la limite de quantification (10 pg/mL). Cette faible limite de quantification garantit une grande flexibilité et une excellente sélectivité dans la conception des expériences. Selon la quantité résiduelle de protéine A dans l'échantillon, celui-ci peut être dilué à 1-0,01 mg/mL, ce qui correspond à une limite de quantification finale de 0,01-1 ppm. Le rapport des densités optiques (DO) entre 10 pg/mL et 0 pg/mL sur la courbe d'étalonnage est supérieur ou égal à 2, assurant ainsi la stabilité et la précision des mesures lorsque la concentration de protéine A dans l'échantillon est proche de la limite de quantification. Il est important de noter que la limite de quantification est spécifique à un échantillon et à un protocole donnés. La limite de quantification du kit est obtenue par validation méthodologique sur des échantillons représentatifs. Lors de l'utilisation de ce kit, les utilisateurs ne doivent pas adopter directement la limite de quantification de 10 pg/mL, mais doivent élaborer un plan de validation méthodologique basé sur les caractéristiques de leurs propres échantillons et leurs besoins de spécification, et définir une limite de quantification raisonnable en fonction des résultats de la validation méthodologique.
5. Le kit a fait l'objet d'une validation méthodologique complète et rigoureuse, conformément à la dernière version de la norme ICH-Q2 (R2). Il a été validé pour son exactitude, sa précision, sa linéarité, sa limite de quantification, sa spécificité et d'autres paramètres, répondant ainsi aux exigences réglementaires relatives à la détection de la protéine A résiduelle dans les anticorps et les médicaments à base de protéines de fusion Fc, et ce, dans différents pays. Le kit est fourni avec un protocole de validation recommandé, mais les utilisateurs peuvent également concevoir leur propre plan de validation en fonction de leurs besoins spécifiques.
Le kit présente une bonne stabilité. Après un mois de stockage à 37 °C, ses performances restent inchangées. L'évaluation de sa stabilité à long terme à température ambiante est en cours. Le kit peut être transporté à température ambiante, mais il est recommandé de le conserver entre 2 et 8 °C pour un stockage prolongé.
Composants
| Réactif | Caractéristiques | Description |
| Plaque pré-enduite d'anticorps anti-protéine A | 8 puits × 12 lanières * 1 assiette | Amovible, recouvert d'un mAb dont la région Fc ne se lie pas à la protéine A |
| Normes universelles de protéine A | 128 ng/mL 120 μL/flacon | Sélectionnez la norme correspondante en fonction de l'échantillon testé ; diluer avec « 1× Tampon de lavage 1 » à 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10 pg/mL. |
| Norme 1 : MabSelect SuRe(Cytiva) | ||
| Norme 2 : MabSelect PrismA(Cytiva) | ||
| Norme 3 : TOYOPEARL AF-rProtein A(HC)-650F(Tosoh) | ||
| Norme 4 : Eshmuno A (Merck) | ||
| Norme 5 : NMab Pro (NanoMicro) | ||
| Norme 6 : UniMab 50HC, NMab (NanoMicro) | ||
| Norme 7 : MabPurixMCA/P(Sepax) | ||
| Standard 9 : Maxtar® ARPA (BioLink) | ||
| Tampon de lavage 1 | 50 ml/flacon (10×) | Diluer avec de l'eau déminéralisée pour obtenir une solution 1× à utiliser comme tampon de dilution pour les standards et les échantillons de protéine A, et comme tampon de lavage lors de la première étape. |
| Anticorps de détection marqué à la biotine | 150 μL/flacon (100×) | mAb avec un sous-type Fc ne se liant pas à la protéine A ; diluer avec « Anticorps de détection et diluant SA-HRP » pour une utilisation unique |
| SA-HRP | 150 μL/flacon (100×) | Diluer avec « Anticorps de détection et diluant SA-HRP » pour une utilisation unique. |
| Anticorps de détection et diluant SA-HRP | 30 mL/flacon (1×) | Utilisé pour diluer « Biotine marquée » Anticorps de détection et « SA-HRP » |
| Tampon de lavage 2 | 30 mL/flacon (10×) | Diluer avec de l'eau déminéralisée pour obtenir une solution 1× à utiliser comme tampon de lavage dans les deuxième et troisième étapes. |
| Solution de substrat TMB | 12 mL/flacon (1×) | Solution contenant 3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine (TMB) et H2LE2; utilisé directement. |
| Solution d'arrêt | 8 mL/flacon (1×) | Solution acide, utilisée directement |
| film de scellage pour plaques | 1 pièce | / |
Remarques : 1. Le standard 8 pour le ligand NGL-ImpactTM A (n° PA-STD-NGL) n'est pas inclus dans ce kit.
Veuillez nous contacter en cas de besoin.
2. Afin de répondre à la demande du marché, la société continuera de proposer des standards de protéine A plus spécifiques, chacun identifié par une référence produit distincte. Ces standards ne sont actuellement pas inclus dans les kits. Veuillez contacter la société séparément si nécessaire.
3. Une cristallisation peut se produire dans le tampon de lavage 1 (10×) et le tampon de lavage 2 (10×). Le produit peut être chauffé et dissous dans un bain-marie à 40-50 °C, puis conservé à température ambiante pendant trois mois.
Storage
Le kit de dosage doit être conservé entre 2 et 8 °C, et sa durée de conservation dans ces conditions est de 3 ans.
Autres réactifs et matériaux nécessaires (non fournis dans le kit)
- Eau déminéralisée
- Réservoir d'échantillons
- Papier absorbant
- Embouts de pipettes à faible liaison avec des volumes allant de 5 à 1000 μL
- Plaque de dilution d'échantillon à faible liaison
- Tubes à centrifuger en polypropylène (par exemple, 1,5 mL, 2 mL, 5 mL, 15 mL) pour la dilution des échantillons ou la préparation des anticorps de détection
- Pipette monocanal avec plage de réglage du volume de 5 à 300 μL et de 300 à 1000 μL, respectivement.
- Pipette multicanaux avec plage de réglage du volume de 5 à 300 μL
- Bouteilles volumétriques adaptées pour contenir « 1× Tampon de lavage 1 » et « 1× Tampon de lavage 2 »
- Lecteur de microplaques capable de mesurer l'absorbance à 450 nm (obligatoire) et à 650 nm
- Agitateur de microplaques (200-500 tr/min)
- Logiciel capable d'effectuer un ajustement de courbe à quatre paramètres (peut également utiliser Microsoft Excel pour le traçage).