Démarrage à chaud de la transcriptase inverse II (sans glycérine) HYA214
La transcriptase inverse Warm Start II est une transcriptase inverse hautement active, obtenue par transformation dirigée par une plateforme de criblage rationnel basée sur la transcriptase inverse Warm Start. Cette enzyme est dépourvue d'activité RNase H et présente une tolérance thermique accrue. Ce produit a été modifié par un procédé de démarrage à chaud afin de bloquer l'activité de la transcriptase inverse à température ambiante, ce qui permet d'éliminer efficacement les effets néfastes de la structure complexe de l'ARN et des facteurs non spécifiques sur la synthèse d'ADNc. Il en résulte une stabilité et une capacité de synthèse par transcription inverse supérieures.
Composants
1. 200 U/µL Transcriptase inverse II à démarrage à chaud
2. Tampon de transcriptase inverse 5×WS (facultatif)
Le tampon de transcriptase inverse 5×WS ne contient pas de dNTP. Veuillez ajouter des dNTP lors de la préparation du système réactionnel.
Stockage
Conserver entre -25°C et -15°C.
Définition de l'unité
1 unité d'activité (U) est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour convertir 1 nmol de dTTP en substances insolubles dans l'acide à 37°C pendant 10 min en utilisant Poly (A)·Oligo (dT).25comme modèle/primaire.
Instructions
1. Reportez-vous au tableau ci-dessous pour préparer le système.
| Composants | Volume |
| ARN matrice | ARN total ≤ 5 µg ; ARNm ≤ 1 µg |
| Oligo(dT)12-18D'abord* | 50 pmol |
| OuAmorce aléatoire * | 50 pmol (20 à 100 pmol) |
| OuAmorce spécifique au gène * | 2 pmol |
| dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 10 μL |
*Choisissez différents types d'amorces en fonction des besoins expérimentaux.
2. Chauffer à 65℃ pendant 5 min, puis refroidir rapidement sur de la glace pendant 2 min ;
3. Ajouter les composants suivants au système ci-dessus pour obtenir un volume total de 20 µL et mélanger délicatement.
| Composants | Volume |
| Tampon de transcriptase inverse 5×WS | 4 µL |
| 200 U/µL Transcriptase inverse II à démarrage à chaud | 1 µL |
| Inhibiteur de RNase à 40 U/µL | 1 µL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
4. Effectuez la réaction dans les conditions suivantes.
1) Si vous utilisez une amorce aléatoire, incubez d'abord à 25℃ pendant 10 min ; puis incubez à 50℃ pendant 30 à 60 min ;
2) Si vous utilisez Oligo dT ou des amorces spécifiques, incubez à 50℃ pendant 30 à 60 min.
5. Inactiver la transcriptase inverse II à démarrage à chaud en chauffant à 95℃ pendant 5 min et arrêter la réaction.
6. Le produit de transcription inverse peut être utilisé directement pour la réaction PCR et la réaction PCR en temps réel, ou stocké à -20℃ pendant une longue période.
Description technique
1. Convient pour l'optimisation de la température de transcription inverse dans la plage de 42℃~55℃.
2. Grâce à sa meilleure stabilité, il convient à l'amplification par transcription inverse à haute température, ce qui permet de traverser efficacement la zone de structure complexe de l'ARN et convient à la détection quantitative par RT-PCR à fluorescence multiplex en une seule étape.
3. Il présente une bonne compatibilité avec diverses enzymes d'amplification PCR et convient aux réactions RT-PCR à haute sensibilité.
4. Il convient à la construction de banques d'ADNc.
5. COURSE 3' et 5'.