Transcriptase inverse Warm Start RTL (sans glycérol) HYB214
La transcriptase inverse Warm Start RTL est une ADN polymérase ARN-dépendante modifiée par un aptamère, dont l'activité de transcription inverse est inhibée en dessous de 40 °C. Dépourvue d'activité exonucléase 3' → 5', elle possède une activité RNase H. Elle peut utiliser l'ARN comme matrice pour synthétiser une chaîne d'ADN complémentaire et est applicable à la synthèse d'ADNc de première chaîne. Grâce à sa forte activité entre 50 et 65 °C, elle est particulièrement adaptée à la RT-LAMP (amplification isotherme à médiation par boucle). L'inhibition de son activité polymérase en dessous de 40 °C permet de réduire considérablement l'amplification non spécifique due à un mauvais appariement des amorces lors de la préparation du système réactionnel, de résoudre le problème de la formation de dimères d'amorces avant la réaction, d'améliorer la reproductibilité et la spécificité de l'amplification, et de permettre des applications à haut débit et un fonctionnement à température ambiante. WS RTL (sans glycérol) peut être utilisé pour préparer des préparations lyophilisées, des réactifs RT-LAMP lyophilisables, etc.
Composants
| Composants | 1500 U | 15000DANS | 150000DANS |
| Transcriptase inverse RTL à démarrage à chaud (sans glycérol) (15 U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| Tampon RTL 10×HH | 1,5 mL | 4 x 1,5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4(100 mM) | 1,5 mL | 2 x 1,5 mL | 3 × 10 mL |
Stockage
À conserver entre -25 et -15 °C, valable 18 mois.
Définition de l'unité
Une unité incorpore 1 nmol de dTTP dans un matériau précipitable à l'acide en 20 minutes à 50 °C en utilisant du poly(A)•oligo(dT)25 comme matrice-amorce.
Contrôle de qualité
1. Activité résiduelle de l'endonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ et 15 unités de RTL incubée pendant 16 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
2. Activité résiduelle de l'exonucléase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg d'ADN λ digéré par Hind III et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37 °C présente le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
3. Activité résiduelle de la nickase : Une réaction de 50 µL contenant 1 µg de pBR322 superenroulé et 15 unités de RTL incubée pendant 4 heures à 37ºC montre le même profil que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
4. Activité résiduelle de la RNase : Une réaction de 10 µL contenant 0,48 µg d'ARN MS2 et 15 unités de RTL, incubée pendant 4 heures à 37 °C, présente le même profil que le contrôle négatif sur gel.
5. E. coliADN génomique :Mesuré avec E. colikits de détection HCD spécifiques, 15 unités de RTL contiennent moins de 1 E. coli génome.
Système de réaction de transcription inverse
| Composant | Volume |
| ARN matrice | facultatif |
| Oligo(dT)18~25 (50 μM) ou mélange d'amorces aléatoires (60 μM) | 2 μL |
| mélange de dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL |
| Transcriptase inverse RTL Warm Start (sans glycérol) (15U/μL) | 0,5 μL |
| Tampon RTL 10 x HH | 2 μL |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 20 μL |
Remarque : La dose recommandée d’ARN total est de 1 ng à 1 µg. La dose recommandée d’ARNm est de 50 ng à 100 ng.
Programme de réaction
| Température | Temps |
| 25 °C* | 5 min |
| 55 °C | 10 min** |
| 80 °C | 10 min |
*Si un mélange d'amorces aléatoires est utilisé, une étape d'incubation à 25 °C.
**Si un mélange d'amorces cibles est utilisé, une étape d'incubation à 55°C pendant 10 à 30 minutes.
Système de réaction RT-LAMP
| Composant | Volume | Concentration finale |
| ARN matrice* | facultatif | ≥10 exemplaires |
| Mélange de dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| Amorces FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Amorces F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Amorce LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 0,5 μL | 20U/Rxn |
| Transcriptase inverse RTL Warm Start (sans glycérol) (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U |
| ADN polymérase Bst 2.0 (8 U/μL) | 1 μL | 8 U |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 x HH RTL Buffer / 10 x HH Bst 2.0 Buffer | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Eau sans nucléase | Jusqu'à 25 μL | - |
Mélanger par agitation douce et centrifuger brièvement pour recueillir. Incuber à température constante entre 60 °C et 65 °C pendant 1 heure.
Notes
1. Ce produit se solidifie en un solide blanc lorsqu'il est conservé à -20 °C. Sortez-le du congélateur et placez-le sur de la glace pendant environ 10 minutes. Après fonte, il peut être utilisé en agitant et en mélangeant.
2. Le produit d'ADNc peut être conservé à -20°C ou -80°C ou utilisé immédiatement pour la réaction PCR.
3. Afin de prévenir toute contamination par la RNase, veuillez maintenir la zone expérimentale propre et porter des gants et un masque propres pendant la manipulation.